免疫组化实验过程包括切片制作（固定，脱水，透明，包埋，切片，贴片，烤片），脱蜡，水化，阻断，抗原修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色，复染，封片，分析。

实验过程常见问题如检测结果阴性，非特异性染色，染色强度不够，着色不均，脱片，干片等，以下总结了所有可能会遇到的问题并且给出了对应的解决方法。

1.标本的固定

固定不及时或固定不完全，导致细胞核模糊，对比不鲜明。

优化建议：

• 组织离体后尽快固定，组织块大小为15×15×5mm，切开固定效果好；

• 固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳；

• 固定时间在4h-48h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果；

• 固定液的量要超过组织体积5倍以上。

2.标本的取材，脱水，浸蜡

如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片。

优化建议：

• 梯度酒精脱水尽量彻底充分；

• 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆；

• 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。

3.标本的切片，捞片，烤片

1）切片太厚导致有刀痕，有褶皱，脱片。

优化建议：

• 切片厚度视组织而定，如同淋巴结、肾等需要比较薄（不超过3um），脑组织需要较厚（尤其是取新鲜标本冰冻制片时），常规都要6-8um最佳，冰冻可切至10um；其他一般如胃肠道、肝胆等等组织，2-4um均可,太厚易掉片，细胞重叠，影响观察。

• 切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。

2）左：乳腺癌组织石蜡切片，Mammaglobin染色阳性，脱片，烤片时间不足。右：乳腺癌组织石蜡切片，MUC6染色阴性，烤片时间充分。

优化建议：

• 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在40℃左右。

• 粘片时需准备蛋白甘油，蛋白甘油由鸡蛋蛋清和甘油配而成，比例为1：1。 先将一滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干。或者玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。

• 烘干温度为50℃，时间为12～24h。

• 4.标本的脱蜡不完全

3）脱蜡不全,组织出现异染现象,异染现象一般是苏木素着色不佳,HE染色没有选择性,染色不均匀。有的是伊红染不上。

建议：

• 根据不同的室温，调节脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。

4.抗原修复

相同组织，不同PH抗原修复液修复结果不一样。没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原。

5.封闭

封闭时间过长，会导致阳性信号减弱甚至出现假阴性。封闭时间不足，会导致背景增强甚至出现假阳性。

优化建议：

• 根据实验实际情况选择合适的封闭试剂和封闭时间。

6.洗涤

染色液的堆积（黑色箭头区域）。

优化建议：

• 充分洗涤。

7.干片

干片导致的假阴性（黑色箭头区域）。

优化建议：

• 加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止切片干燥。

8.边缘效应

边缘效应造成的非特异性染色（黑色箭头区域）。

优化建议：

• 组织切片与玻片黏贴牢固，试剂完全覆盖组织防止干片，加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止边缘效应。

9.一抗的选择

1）抗体特异性

左：癌细胞胞浆强阳性，抗体细胞特异性及细胞亚定位染色正确。 右：癌细胞胞膜弱阳性，抗体细胞特异性正确，细胞亚定位错误，该抗体特异性不准确。

抗体特异性差，定位不准确。

优化建议：

• 抗体的特异性是选择抗体最重要的原则，不同抗体特异性不同，组织特异性，细胞特异性，细胞亚定位的特异性需都准确。

2）抗体的染色强度
左：癌细胞染色胞膜强阳性。 右：癌细胞染色胞膜弱阳性，抗体染色强度不够。

检测结果会出现弱阳性。

优化建议：

• 适当调整抗体稀释比，或者选择染色强度高，高亲和力的抗体。

3）抗体稀释比的影响
左：抗体1:8000稀释，略有背景。 右：调整抗体稀释比例1：30000，背景情况有所改善，抗原染色强度也有所降低。

染色结果出现非特异性染色或者是低背景。

优化建议：

• 当结果出现非特异性染色或者有背景时，可以适当调整一抗的稀释比例进行改善。

4）一抗孵育条件

左：一抗4°C过夜，癌细胞胞浆强阳性，背景干净。

右：一抗37°C-60min，癌细胞胞浆中等强度阳性，背景干净。

孵育条件对染色结果有影响。

优化建议：

• 选择合适的一抗孵育条件。

5）不同组织的影响

HER-2在4个不同乳腺癌的组织标本上的染色结果不同

染色结果与预期不符，检测阴性或者弱阳性。

优化建议：

• 设置阳性组织切片的对照，因为同一蛋白在不同组织中的表达会有很大的差异。

10.二抗选择

左：二抗为HRP直标二抗显色，染色结果弱阳性，低背景。

右：多聚物酶标记二抗显色，染色结果强阳性，背景干净，对比明显。

使用不同的二抗显色系统会出现不同的结果，可能会有弱阳性结果。

优化建议：

• 使用多聚物酶标记二抗比普通的HRP直标二抗灵敏度更高，背景更干净，对比更明显。

11.DAB显色

1）DAB絮状或团状沉积，产生深棕至黑色的DAB絮状或团状沉积于组织切片上。

优化建议：

• 现配现用：因为DAB显色液配置好了之后极容易产生DAB的沉积，从而导致样本上会出现深棕色的絮状沉淀，干扰结果的判定。

• 显色时间：所有说明书上的显色时间均为一个范围，有的反应迅速的30s-3min，有的反应缓慢的3-20min，应该灵活调整，最好是滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。

• 信号偏弱

2）信号偏弱。

优化建议：

• 适当延长显色时间，滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。

12.苏木素使用原则

• 不同的苏木素配方的染色时间各有不同，配置的新旧程度染色时间也不同。

• 国际上常用的为Harris苏木素，因为配方中含汞，通常还需要进行分化，返蓝的步骤，但颜色亮丽。

• 改良的Mayer苏木素配方不需要分化，时间可以根据配置的时间调整染色时间15s-2min。

文章出自：验外实包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/